Auf seiner ersten regulären Fahrt lief das Schiff am 2. April 1938 London an, um im Rahmen einer nationalsozialistischen Propaganda-Aktion den in England lebenden Deutschen und Österreichern Gelegenheit zu geben, über den bereits erfolgten Anschluss Österreichs an das Deutsche Reich abzustimmen.
Bis zum Beginn des Zweiten Weltkrieges am 1. September 1939 wurde die Wilhelm Gustloff als Kreuzfahrtschiff der DAF-Unterorganisation „Kraft durch Freude" (KdF) genutzt. Von Genua aus unternahm das Schiff sechs 10-tägige Fahrten um das mit dem Dritten Reich verbündete Italien. Sechs 5-tägige Kreuzfahrten führten nach Norwegen. Im Jahr 1939 brachte das Schiff die Soldaten der Legion Condor, mit der Hitler den Putsch-General Franco im Spanischen Bürgerkrieg unterstützt hatte, nach Deutschland zurück, ging dann aber nochmals auf Kreuzfahrt.
Nach dem Beginn des Zweiten Weltkrieges wurde die Wilhelm Gustloff am 22. September 1939 als Lazarettschiff der Kriegsmarine übergeben. Während der Besetzung Norwegens im Frühjahr 1940 diente sie als Verwundetentransporter. Ab 20. November 1940 wurde die Wilhelm Gustloff als Wohnschiff für die 2. U-Boot-Lehrdivision in Gdingen.Auch die Wilhelm Gustloff sollte sich an der Evakuierung beteiligen. Am 30. Januar 1945 -- dem 12. Jahrestag der so genannten Machtergreifung Hitlers -- legte sie gegen 13:10 Uhr mit schätzungsweise über 10.000 Menschen an Bord in Gotenhafen ab. Die genaue Anzahl der Passagiere und Besatzungsmitglieder ließ sich nie mit letzter Sicherheit feststellen, da ihre Flucht übereilt erfolgte. Offiziell wurden 7.956 Menschen registriert. Nach Ende der offiziellen Zählung drängten aber noch ungefähr 2.500 weitere Passagiere an Bord. Insgesamt dürften sich auf der Wilhelm Gustloff rund 10.300 Menschen befunden haben: etwa 8.800 Zivilisten, davon eine große Zahl Kinder, sowie etwa 1.500 Wehrmachtsangehörige, darunter 162 Verwundete, rund 340 Marinehelferinnen und 918 Marinesoldaten der 2. U-Boot-Lehrdivision, die von Kiel aus erneut in den Kriegseinsatz gehen sollten. Die Wilhelm Gustloff hatte nur leichten Geleitschutz durch anfangs zwei, dann nur noch ein Begleitschiff.Auf dieser letzten Fahrt der Wilhelm Gustloff befanden sich neben Schiffskapitän Petersen drei weitere Kapitäne an Bord. Sie kannten die drohende Gefahr durch sowjetische U-Boote, konnten sich aber nicht auf ein angemessenes Vorgehen einigen. Der militärische Kommandant, Korvettenkapitän Wilhelm Zahn, schlug vor, abgedunkelt durch flache Küstengewässer zu fahren, in denen U-Boote nicht operieren konnten. Er setzte sich jedoch nicht gegen Kapitän Friedrich Petersen durch, der sich angesichts der Überladung des Schiffes für eine Route durch tiefes Wasser nördlich entlang der Stolpe-Bank entschied. Ein vermeintlicher Funkspruch der Kriegsmarine veranlasste ihn zudem, Positionslichter zu setzen, um die Kollisionsgefahr mit einem angeblich entgegenkommenden Minensuchgeschwader zu verringern. Daher war das Schiff auch in der Dunkelheit auszumachen. Tatsächlich befand sich kein Minensucher auf Gegenkurs zur Wilhelm Gustloff. Anlass und Absender des Funkspruchs konnten bis heute nicht geklärt werden.
Auf der Höhe von Stolpmünde wurde die Wilhelm Gustloff gegen 21 Uhr von dem sowjetischen U-Boot S-13 gesichtet. Um 21:16 Uhr ließ dessen Kommandant, Alexander Iwanowitsch Marinesko, aus etwa 700 Metern Entfernung vier Torpedos abschießen. Ein Torpedo klemmte, drei trafen die Wilhelm Gustloff am Bug, unter dem E-Deck und im Maschinenraum. Nach etwas mehr als einer Stunde, gegen 22:15 Uhr, sank das Schiff etwa 23 Seemeilen von der pommerschen Küste entfernt.Mit über 9.000 Toten ist der Untergang der Wilhelm Gustloff bis heute (2013) die größte Katastrophe der Seefahrtsgeschichte bezogen auf ein einzelnes Schiff.
