생화학 실험 – IPTG induction for TEV protease overexpression (Power Up 100%)

이번 실험에서는 TEV protease-expression vector를 가진 E.coli의 expression strain에 농도별로 IPTG를 처리하여 TEV protease를 overexpression 하는 것이 목적입니다.

먼저 단백질 발현에 사용되는 E.coli strain (Rosetta(DE3))에 TEV protease를 삽입한 pET-21a(+)를transformation 합니다. Transformation으로 얻은 colony를 LB 액체배지 5ml(+Ampicillin 50µg/ml, Chloramphenicol 34µg/ml)에 접종하여 37’C에서 overnight로 배양합니다. LB 액체배지 10ml(+Amp,Cam)에 배양액 100µg를 접종합니다.

그 다음 주기적으로 O.D 값을 측정하여 0.2~0.5 (3조: 0.23)가 될 때까지 37’C에서 shaking incubation을 해줍니다. O.D 값이 0.2 ~ 0.5가 되면 15ml tube 4개에 남은 배양액을 2ml씩 넣습니다. 2ml의 배양액이 들어있는 15ml tube 각각에 IPTG를 0mM, 0.1mM, 0.3mM, 0.5mM 로 넣고 induction을 해줍니다.

여기서 IPTG의 농도를 여러 가지로 처리하는 이유는 IPTG를 처리할 때에는 cell마다 특징이 다르므로 발현이 잘 되는 유전자라도 최적의 조건이 되지 않으면 발현이 잘 되지 않기도 하여, 그 조건을 맞추기 위해서 IPTG 농도, IPTG 처리 전/후의 배양 온도, IPTG 처리 시간 등을 비교해가며 실험해 보아야 합니다.

IPTG 처리 후 2시간 후에 1ml만 cell harvest를 합니다. 실험의 편의상 IPTG 처리 후, 2시간이 경과한 후에 cell을 얻었지만, 정확한 실험을 위해서는 다양하게 시간처리하여야 합니다. IPTG의 induction은 IPTG의 농도, IPTG의 처리 전/후의 배양온도, IPTG 처리 시간에 의해 활성이 달라지므로, 최적의 조건을 찾기 위해서 시간 조건도 다양하게 처리하여야 합니다. 하지만 실험 시간의 제한이 있는 관계로 처리시간을 2시간으로 동일하게 지정하여 실험하였습니다. harvest한 cell은 1X TE buffer 500ug로 washing 후 –80‘C에 보관합니다.