유용한 유전자를 제한효소(restriction enzyme)으로 잘라서 플라스미드 같은 벡터에 연결효소(ligase)를 이용해 붙여주면 재조합 DNA(recombinant DNA)가 만들어집니다.
플라스미드 같은 벡터(vector)는 외래유전자(우리가 도입하고자 하는 유용한 유전자, DNA 조각)를 붙이기 쉽고, 안정적으로 운반하며, 숙주세포에 들어가면 숙주세포가 분열할 때 함께 분열하여 증식되는 능력이 있어야 합니다. 여기에 덧붙여 꼭 필요한 조건이 있습니다.
사람의 눈이나 정밀한 기계로도 벡터가 들어간 숙주세포와 그렇지 않은 세포를 구분할 방법이 없습니다. 숙주세포를 일일이 육안으로 확인할 기술이나 시간이 없습니다. 현미경으로 봐도 외관상 구분이 불가능합니다.
벡터에는 표시유전자(marker gene)가 포함되어 있어야 합니다. 전통적인 마커로는 앰피실린 저항성 단백질을 암호화한 유전자가 있습니다. AmpR로 표시합니다. AmpR 유전자가 들어있는 플라스미드로 만든 재조합 DNA가 들어간 숙주세포는 플라스미드가 만든 앰피실린 저항성 단백질때문에 앰피실린을 처리해도 살아남습니다. 이렇게 재조합 DNA가 들어있는 미생물만 추려서 번식시키면 됩니다.
출처: 위키백과
대장균(Escherichia coli)과 궁합이 좋은 pBR322 플라스미드입니다. amp는 앰피실린 저항성 유전자, tet는 테트라사이클린 저항성 유전자입니다. 이 플라스미드에 유용한 외래 유전자를 포함한 DNA조각을 붙여넣어 숙주세포에 집어넣으면 저항성 유전자에서 나온 복사본은 mRNA를 통해 항생제 저항성 단백질이 만들어져서 세포가 항생제에 저항성을 갖게 됩니다.
EcoRI, HindIII처럼 파란색으로 표시된 것이 해당 제한효소가 자를 수 있는 제한 자리(restriction site)입니다.
5'GAATTC 3'CTTAAG
5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5'
5'AAGCTT 3'TTCGAA
5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5'
자세히 보시면 저항성 유전자가 amp와 tet로 2개인 것을 알 수 있습니다. 만일 3607 bp 자리에 있는 PstI 제한자리에 외래유전자를 삽입하면 앰피실린 저항성은 없어집니다. 그럼 테트라사이클린에만 저항성이 있고, 앰피실린에는 저항성이 없는 숙주세포만 고르면 됩니다.
이제 벡터에 외래유전자를 삽입하여 재조합 DNA를 만들었으니, 대장균 같은 숙주세포에 넣어줄 차례입니다. 지금 사용하는 벡터인 pBR322 플라스미드는 대장균에 있던 것이니 상성이 좋습니다. 대장균의 세포막에 충격을 주어 플라스미드가 들어갈 구멍만 내주면 됩니다.
보통 50mM 정도의 염화칼슘을 처리하면 세포막을 통과하기 쉬워집니다. 이 틈을 타 대장균 같은 박테리아 세포 내부로 들어간 재조합 DNA(벡터+외래유전자)는 숙주세포가 분열할때마다 덩달아 복제되어, 늘어난 숙주세포 수 만큼 증식하게 됩니다.
이렇게 유전자를 복제하는 기술을 유전자 클로닝이라고 합니다.
향문사 재배학을 해설하고 있습니다. 88P에 해당되는 내용입니다.
