Determinação de Nitrogênio

Determinação de Nitrogênio Total em Leite e derivados Lácteos pelo método
de Micro-Kjedahl
1 Escopo
Este MET tem como objetivo determinar os procedimentos para o ensaio “Determinação de
Nitrogênio Total em Leite e Derivados Lácteos utilizando o método de Micro-Kjedahl”.
É aplicável para:
a) leite fluido in natura ou nas apresentações integrais, semidesnatadas e desnatadas, tratadas
por processos de UHT ou pasteurização;
b) derivados lácteos desidratados (leite em pó, caseína, caseinatos e soro);
c) queijos;
d) creme e doce de leite;
e) bebidas lácteas e leite fermentado.
2 Fundamentos
A fração nitrogenada do leite possui nitrogênio de duas fontes: (1) protéico, da caseína e das
proteínas do soro e, (2) nitrogênio não protéico – NNP. A caseína é o principal componente da
fração protéica do leite perfazendo cerca de 80% do total das proteínas presentes no produto. Ela
encontra-se na forma de um complexo, o fosfocaseinato de cálcio. Outros componentes protéicos
encontrados no leite são as proteínas do soro lácteo que constituem cerca de 20% da fração
protéica do leite e, portanto, juntamente com a caseína perfazem praticamente o total das proteínas
presentes no leite. Entre as proteínas do leite encontra-se número bastante elevado de enzimas
(fosfatase, lactoperoxidase, catalase, etc.), muitos dos quais tem notável importância na
industrialização do leite e seus derivados. Os compostos nitrogenados presentes na fração de NNP
são basicamente produtos finais do metabolismo do nitrogênio e representam de 5 a 6% do
nitrogênio total. Entre estes compostos estão uréia, peptídios, aminoácidos, ácido úrico, creatina e
creatinina.
A proteína do leite é comumente expressa como proteína total ou proteína bruta e sob o ponto
de vista analítico, corresponde ao teor percentual de nitrogênio total (NT) multiplicado pelo fator de
conversão 6,38 conseqüente do teor médio de 15,67% de nitrogênio nas proteínas do leite.
O método de Kjeldahl baseia-se na transformação do nitrogênio da amostra em sulfato de
amônio através da digestão com ácido sulfúrico e posterior destilação com liberação da amônia,
que é fixada em solução ácida e titulada.

Este método é dividido em três etapas principais: a digestão, destilação e titulação.
a) Digestão: nesta etapa ocorre o aquecimento da amostra com ácido sulfúrico concentrado até
que o carbono e hidrogênio sejam oxidados. Com a finalidade de aumentar a temperatura de
ebulição do ácido e aumentar a velocidade de oxidação da matéria orgânica é adicionada à
reação uma mistura catalítica.
Durante a digestão, o carbono é transformado em dióxido de carbono (CO2) e o hidrogênio em
água (H2O). O nitrogênio da proteína é reduzido e transformado em sulfato de amônio, conforme
reação abaixo:
3 2 2 2 4 2 4
2 4 SO SO CO H O (NH ) SO
H SO
Matéria orgânica + + + +
D
b) Destilação: o objetivo desta etapa é transformar o nitrogênio presente na solução na forma de
sulfato de amônio (NH4+) para NH3 gasoso. Com adição de NaOH concentrado e aquecimento,
ocorre a liberação da amônia que é separada da mistura por destilação. O gás então reage com
uma solução de ácido bórico, formando borato de amônio.
4 2 4 (NH ) SO + 2NaOH 2 4 ¾¾® Na SO D + ­ 3 2NH + 0 2 H
3 NH + ® - 3 3 4 2 3 H BO NH H BO
c) Titulação: a etapa final consiste na titulação do borato de amônio com uma solução de ácido
sulfúrico padronizada.
4 2 3 2 4 2 4 3 3 2NH H BO - + H SO ® (NH4) SO + 2H BO
Quanto maior o volume de ácido sulfúrico gasto na titulação, maior a quantidade de nitrogênio
presente na amostra.
3 Reagentes, padrões e materiais
3.1 Reagentes:

1. Ácido sulfúrico (H2SO4) p.a.;
2. Indicador misto: pesar cerca de 0,132 g de vermelho de metila (C15H15N3O2) e cerca de 0,06
   g de verde de bromo cresol (C21H14Br4O5S). Dissolver em aproximadamente 200 mL de
   solução de álcool etílico a 70 % (v/v). Filtrar se necessário e guardar em frasco âmbar. O
   indicador misto pode ser incorporado à solução de ácido bórico a 4 % na proporção de 8 mL
   por litro;
3. Mistura catalítica:
   a) Sulfato de potássio (K2SO4) p.a., sulfato de sódio anidro (Na2SO4) p.a. ou bissulfato de
   potássio (KHSO4) p.a.;
   b) Sulfato de cobre penta hidratado (CuSO4.5H2O) p.a.;
4. Misturar (a) e (b) na proporção de (10+1), triturando em gral de porcelana até obter um pó
   fino.
5. Solução de ácido bórico (H3BO3) a 4 % (m/v): pesar cerca de 4 g de ácido bórico p.a.,
   transferir para um béquer de 250 mL, adicionar aproximadamente 80 mL de água e aquecer
   sob agitação branda até dissolução. Resfriar, transferir para balão volumétrico de 100 mL e
   completar com água. Filtrar se necessário;
6. Solução de hidróxido de sódio (NaOH) a 50 % (m/v);
7. Solução padrão de ácido sulfúrico (H2SO4) 0,1 N ou solução padrão de ácido clorídrico (HCl)
   0,1 N;
8. Zinco metálico granulado;
9. Anti-espumante (talco, parafina ou silicone).
   3.2 Materiais
10. Tubo de Kjeldahl de 100 mL;
11. Béquer de 250 mL;
12. Buretas de 25 ou 50 mL;
13. Frasco de Erlenmeyer de 125 ou 250 mL;
14. Espátula;
15. Papel de pesagem (papel vegetal livre de nitrogênio);
16. Pipeta graduada de 1 e 10 mL ou material volumétrico similar;
17. Provetas de 50 mL ou material volumétrico similar;
18. Tenaz metálica.

4 Equipamentos

1. Bloco digestor e destilador micro-Kjeldahl;
2. Balança analítica.
   5 Precauções analíticas
3. Verificar as condições do aparelho de destilação com solução padrão de sulfato de amônio
   ((NH4)2SO4) p.a., cuja recuperação deve ser no mínimo 99,5 % em nitrogênio.
4. Para produtos muito gordurosos, digerir a amostra com adição de um anti-espumante.
5. Para a pesagem de algumas amostras, como por exemplo, doce de leite, é necessário
   utilizar papel livre de nitrogênio.
6. Como ocorre o desprendimento de vapores irritantes pelo aquecimento do ácido, realizar a
   etapa de digestão da amostra dentro de uma capela de exaustão.
   6 Procedimentos
   O método é usualmente classificado em macro, semi-micro e micro Kjeldahl conforme a
   quantidade absoluta de proteína na amostra que vai sofrer digestão. No laboratório utiliza-se o
   procedimento micro-Kjeldahl e realiza a determinação em duplicata.
   6.1 Método micro Kjeldahl
   6.1.1 Digestão ou mineralização:
7. Pesar em balança analítica exatamente a quantidade de amostra de acordo com a tabela I e
   transferir para tubo de Kjeldahl;
8. Adicionar cerca de 2,5 g de mistura catalítica e 7 mL de ácido sulfúrico p.a.;
9. Aquecer o tubo em bloco digestor da seguinte forma: no caso de amostras líquidas, aquecer,
   a princípio lentamente (iniciar com temperatura em torno de 120ºC por cerca de 30 minutos);
   logo após, aumentar para 250ºC (em torno de 30 minutos) elevando gradativamente para
   450ºC até que o líquido se torne límpido e transparente, de tonalidade azul-esverdeada.
   Para amostras com baixa umidade (ex. leite em pó), o aquecimento é iniciado a 250ºC (em
   torno de 30 minutos) e elevar a 450ºC da mesma forma descrita para amostras líquidas.

6.1.2 Destilação:

1. Acoplar ao destilador um erlenmeyer contendo cerca de 20 mL de solução de ácido bórico a
   4 % com 4 ou 5 gotas de solução de indicador misto (erlenmeyer receptor do destilado);
2. Adaptar o tubo de Kjeldahl ao destilador e adicionar a solução de hidróxido de sódio a 50 %
   até que a mesma se torne negra (cerca de 20 mL);
3. Proceder à destilação. Recolher o volume necessário para a completa destilação da amônia
   (aproximadamente 75 mL). A solução coletora é mantida fria durante a destilação.
   6.1.3 Titulação:
   Titular com solução de ácido sulfúrico 0,1 N ou solução de ácido clorídrico 0,1 N até a viragem
   do indicador (coloração verde à leve tom róseo - avermelhado).
   6.2 Verificação do destilador através da avaliação de recuperação de nitrogênio na
   destilação
   Realizar a verificação das condições do aparelho de destilação com solução padrão de um sal
   de amônio, cuja recuperação deve ser no mínimo 99,5% em nitrogênio conforme procedimento
   descrito na IU do destilador.

7 Resultados
Os dados brutos obtidos na determinação do nitrogênio total são registrados em formulários
específicos descritos no POP POA/06 - Controle de Itens de Ensaio Leite e Derivados Lácteos e
inseridos em planilhas eletrônicas conforme IT POA/04 para que os resultados sejam calculados
automaticamente.
O cálculo é obtido através da seguinte fórmula
% nitrogênio total =
m
Vx N x0,014 x100
Onde,
V = volume da solução de ácido sulfúrico 0,1 N, ou solução de ácido clorídrico 0,1 N, gasto na
titulação após a correção do branco, em mL;
N = normalidade teórica da solução de ácido sulfúrico 0,1 N ou solução de ácido clorídrico 0,1
N;
f = fator de correção da solução de ácido sulfúrico 0,1 N ou solução de ácido clorídrico 0,1 N;
m = massa da amostra, em gramas.
O método de Kjeldahl quantifica o nitrogênio total da amostra. Para que seja obtido o teor em
proteínas, aplica-se um fator, chamado “fator de conversão Kjeldahl”.
% protéidios = % nitrogênio total ´ F
F = fator de conversão da relação nitrogênio/proteína, F = 6,38.
Como a determinação é feita em duplicata, expressar o resultado da média (teor de proteínas
%) com uma casa decimal.
7.1 Critérios para a repetição do ensaio:

1. Se a diferença entre as duplicatas for maior do que 3% repetir a determinação de nitrogênio
   com uma nova alíquota da amostra.
2. Outro critério considerado em conta numa eventual repetição do ensaio é o fechamento
   centesimal dos componentes do leite. A soma dos teores de açúcares (lactose), proteínas e
   cinzas (resíduo mineral fixo) deve ser próximo ao ESD: quando a diferença entre estes
   resultados for superior a 5%, a determinação dos glicídios redutores em lactose é repetida
   para confirmação, se possível em nova embalagem. Se confirmar o resultado, repetir então o
   EST, a gordura, a proteína e cinzas.
   8 Arquivamento dos registros
   Os formulários utilizados nesta metodologia são arquivados conforme procedimento descrito no
   POP POA/06 – Controle de Itens de ensaio Leite e Derivados Lácteos e IT POA/04 – Uso de
   Planilha Eletrônica na Revisão de Cálculos de Dados Brutos nas Análises de Leite, Derivados
   Lácteos, Água e Mel.
   9 Referências
   BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Regulamentos Técnicos de
   Identidade e Qualidade dos Produtos Lácteos. Portaria 146, 07/03/96. Brasília: Ministério da
   Agricultura, 1996.
   BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Regulamento Técnico para
   Fixação de Identidade e Qualidade de Doce de Leite. Portaria 354, 04/09/97. Brasília: Ministério
   da Agricultura, 1997.
   BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria de Defesa Agropecuária. "Padrões de Identidade
   e Qualidade (PIQ) de Leites Fermentados". Resolução 5, 13/11/00. Brasília: Ministério da
   Agricultura, 2000.
   BRASIL. Ministério da Agricultura. Regulamentos Técnicos de Produção, Identidade e
   Qualidade do Leite. Instrução Normativa 51, 18/09/02. Brasília: Ministério da Agricultura, 2002.
   BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria de Defesa Agropecuária. Regulamento Técnico
   de Identidade e Qualidade de Leite de Cabra. Instrução Normativa 37, 31/10/00. Brasília:
   Ministério da Agricultura, 2000.
   BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria de Defesa Agropecuária. Métodos Analíticos
   Físico-Químicos para Controle de Leite e Produtos Lácteos. Instrução Normativa 68, 12/12/06.
   Brasília: Ministério da Agricultura, 2006.