Ultra centrifugation은 매분 수만 회전 이상을 회전하는 초원심기를 이용하여, 용액 중의 용질을 분리하는 것입니다. 원심력의 가속도는 중력가속도의 수십만 배에 달하며, 단백질분자와 같은 작은 콜로이드 입자나 세포의 단편, 세포내 여러 기관을 용이하게 분리할 수 있습니다. 또한, 별도로 초원심분석이 있으며, 이것은 원심력장에서 물질의 침강법으로 분자량을 구하거나 물질을 분석하는 것입니다. 우리는 이번 실험에서 Fixed angle rotor인 Ti-70 기기를 이용하여 centrifugation을 시도할 것입니다.
분리용원심기를 사용하여 침강계수의 차를 이용하여 고분자 물질의 분리 분석을 할 때에 사용합니다. 설탕 농도가 상이한 중층한 용액, 5-20%의 설탕밀도 기울기(직선)을 사용하면 고분자 물질의 침강이 일정한 속도가 되어 분획됩니다. 단백질, DNA, RNA, 파지, 바이러스 등의 침강속도 측정, 분리, 정제에 사용됩니다. sucrose density gradient 방법에는 총 3가지가 있습니다.
(1) Step-gradient : 1ml 50% sucrose를 넣고, 그 위에 조심스럽게 벽을 타서 1ml 40% sucrose를 넣습니다. 순서대로 30, 20, 10%도 동일방법으로 조심히 넣어 gradient를 형성시킵니다. 손이 매우 섬세해야 하며 실패할 경우가 많습니다.
(2) Thistle tube method : Thistle tube를 튜브 바닥에 붙인 다음 10% sucrose를 먼저 넣어줍니다. 그 후 20%을 넣어주어 점차 10% 층이 위로 올라가도록 합니다. 총 볼륨이 클 경우에는 hooked tip을 사용합니다.
(3) Freeze-thaw : 50% sucrose를 먼저 넣고 얼린 후 그 위에 40%를 붓고 다시 얼리는 형태로 만듭니다. 가장 쉬운 방법이며 실패할 확률이 적으나 시간이 오래 걸립니다.
실험 재료로는 sample, thistle tube, 23% sucrose solution, Ti-70 (Fixed andgle rotor), phosphate buffer, sucrose, poly carbonate Pp tube 을 준비합니다.
Thistle tube는 끝이 뾰족한 형태로 액체를 조금씩 흘러내리게 하여 맨 아래부터 층을 형성하도록 하는 실험에서 사용하는 실험기구입니다. 저희 조는 step-gradient 방법으로 sucrose density gradient를 형성하였습니다. 벽면을 타고 sucrose가 흐르게 하며 방울이 떨어질 때, 표면장력을 깨지 않도록 주의하면서 넣으면 sucrose 사이의 층이 흩어지지 않습니다.
Sucrose cushion은 sample이 이 cushion을 통과하면서 더욱 더 깨끗하게 걸러지므로, 필터 역할을 합니다. Fixed-angle rotor를 이용하여 원심분리를 하였으며, sucrose cushion을 넣은 tube에는 침전물이 해파리 모양처럼 둥글게 형성되며 투명하고, sucrose cushion을 넣지 않은 tube는 혼탁한 색으로 형성되었습니다.