림프기관은 외부 병원체에 대한 면역반응을 담당하는 세포들을 만들어내고, 면역기능을 수행하는 기관으로 1차 림프기관과 2차 림프기관이 있습니다. 1차 림프기관은 면역세포가 발달하는 기관으로 골수와 흉선이 포함됩니다. 골수는 혈구줄기세포를 적혈구, 백혈구 등으로 성숙, 분화시키는 장소입니다. 흉선은 혈구줄기세포를 T림프구로 성숙, 분화시키는 장소입니다. 2차 림프기관은 1차 면역기관에서 만들어진 면역세포가 이동하며 존재하며 외부에서 들어온 항원을 인지하는 장소입니다. 림프절, 비장, 점막 림프조직이 있습니다. 두 림프기관을 확인 및 적출을 하기 위해 마우스 해부 실험을 진행하였습니다. 동물 실험을 할 때에는 생명의 소중함을 생각하며 경건한 마음으로 진행하여야 합니다. 쥐가 가장 고통받지 않도록 Ether로 마취를 시키거나, 경추를 탈골시키는 방법을 사용합니다.
이번 실험에서는 경추탈골 법을 진행하였습니다. 경추탈골 후 사망에 이르게 하여도 신경이 살아있어서 전기적 신호에 의해 발작 증세가 일어날 수 있으니 주의해야 하며 쥐가 가장 고통받지 않도록 단시간에 시행하여야 합니다. 약수저로 목부분을 고정 시 너무 힘을 주어 질식사 하지 않도록 해야 합니다. 쥐의 사망을 눈색으로 확인 후 해부판 위에 사지를 고정시킵니다. 핀으로 고정시에는 밖에서 몸 안쪽 방향으로 찔러 넣어야 잘 고정이 됩니다. 항문 부위에 칼집을 낸 후 턱 아래까지 일자로 절개하여 가죽을 먼저 고정시킨 후 복막 절개를 합니다. 쥐를 경추탈골 시킬 때 쥐의 심장이 매우 연약하여 그 충격에 의해 터지는 경우가 있으므로 혈액의 고임을 생각하며 조심히 절개해야 합니다.
절개 후 소장과 대장을 조심히 들어내면 흰 지방이 별모양처럼 장 속에 퍼져있고 실핏줄이 보이는 부분이 있는데 이 부위가 림프절입니다. 더 들어내면 약 1cm의 작은 엽이 보이는데 이는 제 2림프기관인 비장입니다. 비장 위로 제일 뒷부분에는 2개의 강낭콩 모양의 콩팥을 관찰할 수 있습니다. 위쪽을 관찰해보면 4개의 선홍빛 옆이 덮여 있으며 이는 간장입니다. 갈비뼈 부분을 조심히 절개하여 그 안을 관찰해 보면 심장, 하얀 폐, 불투명한 흰색의 가슴샘, 위를 관찰할 수 있습니다. 이번 실험에서는 경추탈골 시 심장이 손상되어 그 형태는 관찰하지 못했습니다. 이 중 spleen을 적출하여 0.01M PBS에 담급니다. PBS는 Phosphate buffer saline 로 세포의 고유한 pH, 삼투 농도와 매우 유사한 용액으로 세포에 부담을 주지 않습니다.
foreps를 이용하여 잘게 부순 후 불순물을 걸러주고 세포 현탁액을 튜브에 모읍니다. NH4Cl 처리 후 washing 작업을 합니다. 세포 현탁액과 trypan blue dye를 잘 섞은 후 Hemacytomer를 이용하여 세포의 수를 셉니다. NH4Cl은 적혈구를 파괴시키기 위해 처리해주는데, 상대적으로 삼투압에 민감한 적혈구를 터트리는 방법을 이용합니다. Bcell을 활성화 시키기 위해 LPS를 처리해줍니다. LPS는 면역세포 활성화 물질로 Bcell의 증식, 분화, 활성화를 시킵니다. 24 well culture plate에 seeding 합니다. 이는 RT-PCR 실험을 위한 것으로, 오래 배양하면 사라질 수 있으므로 2일만 배양합니다. 96 well culture plate에 seeding 하여 B cell 항체분비 정도를 확인 하기 위해 7일간 배양합니다. 적은양으로 오래두어야 배지에 항체가 많이 떠다닐 수 있습니다. hemacytometer으로 세포의 수를 계산할 때는 보통 위, 아래 두 모눈 부위를 관찰하여 평균을 내는 것이 가장 정확하고, 모눈 칸은 9칸 중 다섯칸을 세어 평균을 내는 것이 좋습니다. cell 수는 63개가 나왔으며, 총 40ml volume이고 dye로 2배 희석하였기 때문에 희석배수를 곱하여 총 세포의 개수를 구할 수 있습니다.
