ELISA는 오늘날 가장 널리 이용되는 면역정량법입니다. 이 방법은 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 반응을 확인하는 방법으로, 간단하고 비용이 많이 들지 않으며, 다량 분석이 가능하여 현재 가장 많이 사용되고 있는 항원-항체 분석법중 하나입니다. 항원의 농도는 기질 전환 농도에 따라 결정되는데, ELISA라는 명칭으로부터 항체나 항원이 고체상에 흡착되어 있는 원리를 이용함을 알 수 있습니다. 이 방법은 mouse나 rabbit 등을 immunization 한 후 얻은 serum이나, fusion을 통하여 얻은 hybridoma의 culture supernatent 안에 우리가 원하는 antibody가 생성되어 있는지를 확인하기 위한 실험입니다.
ELISA는 특정한 항원 또는 항체를 검출하는 방법으로써 특정한 항체를 검출하기 위해서는 항원을 plastic well 내부에 고정시킨 후 검출하고자 하는 혈청과 반응시킵니다. 고정된 항원과 결합하지 못하는 항체는 씻어 없어집니다. 항원과 결합한 항체는 anti-immunoglobulin antibody와 효소의 conjugate로 검출한 후, 적당한 기질을 넣고 기질의 변화를 봅니다.
우리가 실험에 사용한 항체는 IgM과 IgA입니다. IgM은 감염 초기에 있어 세균 감염의 일차 면역의 방어선이며 IgA는 눈물, 침, 땀, 점액, 분비액에 다량으로 존재하며, 호흡기와 소화기 같은 점액을 통한 세균 감염에서 중요한 역할을 하는 항체입니다. 이 외에도 B림프구에서 분비되는 항체는 IgG, IgE, IgD를 포함하여 5가지가 존재합니다. 우리는 이 항체들에 LPS와 TGF-b1를 처리하여 그 활성도를 확인하였습니다. LPS는 lipoolysaccharide이며, 그람음성세균의 세포벽에 존재하는 지질 다당류 물질입니다. B세포 유사분열 물질이며, 염증성 반응을 유지할 수 있고, 면역 보강체로 사용할 수 있습니다. TGF-b1은 Transforming growth factor b1으로 염증반응에 관여하는 사이토카인입니다. b세포에 작용하면 선택적으로 IgA의 분비를 촉진합니다. 또한 우리는 항원특이적 항체를 coating한 후 항원을 넣어서 검출하는 sandwich ELISA법을 이용하였고, 발현도를 보기 위한 실험이기 때문에 항체 coating 후 항체를 넣어주었습니다. 먼저 3조는 ELISA plate를 1.2ug/ml 농도의 goat-anti-mouse IgA antibody로 coating 하였습니다. coating buffer로는 0.05M sodium bicarbonate (pH 9.3)을 이용하였습니다. 이 plate를 PBST로 잘 세척 후 blocking solution인 gelatin을 넣어 1시간 incubation 하였습니다.
3조는 IgA-LPS+TGF-b로 sample 측정 결과 (816.824, 1498.016, 1171.456, 980.96, 705.728, 305.408) 값이 나왔으며 이의 평균값은 913.0653 ng/ml로 계산되었습니다. 평균값의 표준오차는 166.8434ng/ml 이었습니다. LPS를 처리한 값과 LPS+TFG-b를 처리한 값을 비교하면 LPS+TGF-b의 값이 더 크므로 TGF-b1이 IgA 항체의 면역 활성화에 영향을 미쳤음을 확인할 수 있습니다. ELISA plate로 실험할 때에는 기계의 측정 부분인 밑면에 이물질이나 손이 닿지 않도록 주의해야 하며, pipette으로 세포를 긁어 손상시키는 일이 없고, 거품을 많이 내어 기계의 오측정이 생기지 않도록 주의하며 실험해야 합니다.
